파이로 시퀀싱 Pyrosequencing

파이로 시퀀싱 Pyrosequencing

파이로 시퀀싱 은 시퀀싱이 DNA 중합 효소에 의해 통합 된 뉴클레오티드를 검출함으로써 수행되는 "합성에 의한 시퀀싱"원리에 기초한 DNA 시퀀싱 ( DNA 에서 뉴클레오타이드 의 순서를 결정 )의 방법이다 . 파이 로 시퀀싱은 피로 포스페이트 가 방출 될 때 연쇄 반응에 기초한 광 검출에 의존한다 .

Pyrosequencing의 원리는 1993 년에 설명 된 [1] 에 의해 베르 틸 Pettersson은 , 마티아스 Uhlen 및 팔 니린 결합으로 고상 시퀀싱 방법 [2]를 사용하여 스트렙 5'exonuclease 활성 3 '부족한 재조합 DNA 폴리머로 코팅 된 자성 비드 (증명 - 읽기) 및 반딧불이 루시퍼 라제 효소를 이용한 발광 검출 . [3] 3 개의 효소 ( DNA 중합 효소 , ATP 황화 효소 및 반딧불이 루시퍼 라제 )와 뉴클레오타이드 ( dNTP)을 서열화 될 단일 가닥 DNA에 첨가하고 뉴클레오티드의 혼입 후에 발광 된 빛을 측정한다. 빛의 강도는 0, 1 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 혼입되었는지를 결정하며, 따라서 다수의 상보적인 뉴클레오티드가 주형 가닥 상에 존재 하는지를 나타낸다. 뉴클레오티드 혼합물은 다음 뉴클레오티드 혼합물이 첨가되기 전에 제거된다. 이 과정은 단일 가닥 주형의 DNA 서열이 결정될 때까지 네 개의 뉴클레오타이드 각각에 대해 반복된다.

Pyrosequencing하는 제 용액 계 방법은 1998 년에 기술되었다 [4] 에 의해 무스타파로나 기 , 마티아스 Uhlen 및 팔 니린 . 이 대안 방법에서, DNA 폴리 메라 제에 의해 혼입되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하기 위해 부가 효소 아피라 아제가 도입된다. 이로써 DNA polymerase , luciferase 및 apyrase 가 포함 된 효소 혼합물 이 처음부터 추가되고 절차 전반에 걸쳐 유지되어 자동화에 적합한 간단한 설정을 제공 할 수있었습니다. 이 원리에 기초한 자동화 된 도구는 다음 해 파이로 시퀀싱 (Pyrosequencing) 회사에 의해 시장에 소개되었습니다.

Pyrosequencing 방법의 세 번째 마이크로 유체 변종은 2005 년에 기술되었다 [5] 에 의해 조나단 로스 버그 회사에서 동료 454 개 생명 과학 . 파이로 시퀀싱 (Pyrosequencing)을위한이 대체 접근법은 시퀀싱 할 DNA를 고체 지지체에 부착하는 원래의 원리를 기반으로했으며 마이크로 패브릭 마이크로 어레이를 사용하여 매우 평행하게 시퀀싱을 수행 할 수 있음을 보여주었습니다 . 이로 인해 처리량이 많은 DNA 시퀀싱이 가능 해지고 자동화 된 계측기가 출시되었습니다. 이것은 새로운 시대를 시작하는 첫번째 차세대 시퀀싱 계기가되었다 유전체학 에 대한 빠른 속도로 가격 하락과 연구, DNA 시퀀싱 허용합리적인 가격으로 전체 게놈 시퀀싱 .

절차 [6]

파이로 시퀀싱 작동 원리

이 도표는 파이로 시퀀싱이 어떻게 작동하는지 보여줍니다.

"합성에 의한 염기 서열 결정"은 염기 서열을 결정할 DNA의 단일 가닥을 취하여 그 상보 적 가닥을 효소 적으로 합성하는 것을 포함한다. 파이로 시퀀싱 (pyrosequencing) 방법은 DNA 중합 효소 (DNA 합성 효소) 의 활성을 다른 화학 발광 효소로 검출하는 것을 기본으로합니다 . 본질적으로이 방법은 한 번에 하나의 염기쌍과 함께 상보 적 가닥을 합성하고 각 단계에서 실제로 염기가 추가되었는지를 검출함으로써 DNA 의 단일 가닥을 시퀀싱 할 수 있습니다 . 주형 DNA는 움직이지 않으며 A, C, G, T 뉴클레오타이드의 용액반응에서 순차적으로 첨가되고 제거된다. 뉴클레오티드 용액이 주형의 첫 번째 짝이없는 염기를 보완 할 때만 빛이 생성됩니다. 화학 발광 신호를 생성하는 솔루션의 순서는 템플릿의 순서의 결정을 허용합니다.

Pyrosequencing 용액 기반 버전의 경우, 상기 단일 가닥 DNA는 ( ssDNA를 ) 템플릿은 시퀀싱에 혼성화되어 프라이머 및 효소와 인큐베이션 DNA 중합 효소 , ATP의 sulfurylase , 루시퍼 라제 와 apyrase , 상기 기판과 아데노신 5'-의 phosphosulfate (APS)를 및 루시 페린 .

4 개의 deoxynucleotide triphosphates ( dNTPs ) 중 하나 (dATPαS, 루시퍼 라제의 기질이 아닌 것, dATP 대신에 dATP가 첨가 됨)가 추가되어 두 번째 단계가 시작됩니다. DNA 중합 효소는 올바른 상보적인 dNTP를 주형에 결합시킵니다. 이 결합은 피로 포스페이트 (PPi)를 방출 한다.

ATP의 sulfylase는 아데노신 5 '포스 포 설페이트 (phosphosulfate)의 존재 하에서 PPi를 ATP 로 전환시킨다 . 이 ATP는 ATP의 양에 비례하는 양의 가시 광선을 생성하는 루시퍼 라제의 옥시 루시퍼로의 루시퍼 라제 매개 형 변환을위한 기질로서 작용한다. 루시퍼 라제 촉매 반응에서 생성 된 빛은 카메라로 검출되어 파이로 그램에서 분석됩니다.

합병되지 않은 뉴클레오티드 및 ATP는 아피라 제에 의해 분해되고 , 반응은 다른 뉴클레오타이드로 재개 될 수있다.

현재 방법의 한계는 DNA 서열의 개별 판독 길이가 체인 종결 방법 (예 : 생거 시퀀싱)으로 얻을 수있는 800-1000보다 짧은 300-500 개의 뉴클레오티드 근처에 있다는 것 입니다. 이것은 게놈 조립 과정을 더욱 어렵게 만들 수 있습니다 . 특히 대량의 반복 DNA가 포함 된 서열의 경우 더욱 그렇습니다 .

상용화 

스웨덴의 Uppsala에 소재한 Pyrosequencing AB 회사는 Pyrosequencing 기술을 사용하여 DNA의 짧은 서열을 시퀀싱하기위한 기계 및 시약을 상업화하기 위해 HealthCap 에서 제공 한 벤처 캐피탈을 통해 설립되었습니다 . Pyrosequencing AB는 1999 년 스톡홀름 증권 거래소 에 상장 되었으며 2003 년 Biotage 로 변경 되었습니다. Pyrosequencing 비즈니스 라인은 2008 년 Qiagen 에 인수되었습니다 . Pyrosequencing 기술은 454 Life Sciences에 라이센스되었습니다 . 454는 대규모 DNA 시퀀싱을 위한 플랫폼으로 떠오른 어레이 기반 파이로 시퀀싱 기술을 개발했습니다 . 가장 주목할만한 것은게놈 시퀀싱 및 메타 게 노믹 . Roche 는 2013 년에 454 시퀀싱 플랫폼을 중단한다고 발표했습니다.

참고 문헌 

 분석 생화학 208 (1), 171-175, "효소 Luminometric 무기 인산염 검출 분석법 고체상 DNA Minisequencing"Nyren, 피터슨과 Uhlen (1993)https://doi.org/10.1006/abio.1993.1024

 733-4 : Uhlen (1989) "DNA의 자기 분리"자연 (340)https://doi.org/10.1038/340733a0을

 504-509 : Analytiocal 생화학 151 (2) 「무기 인산염 합성 효소의 연속 모니터링을위한 방법 "및 Nyren 룬딘 (1985). https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90211-8

 과학 Ronaghi, Uhlén 및 Nyrén (1998) "실시간 피로 인산 기반으로 sequenbcing 방법". 281 (5375) : 363.https://doi.org/10.1126/science.281.5375.363.

 Marguiles 등 자연 437, 376-380 (2005) "원자로 picolitre 미세 고밀도의 게놈 시퀀싱". https://doi.org/doi:10.1038/nature03959;

 QIAGEN 오르십시오. "파이로 시퀀싱 기술 및 플랫폼 개요" . 검색된 4 월 4 일 2017 .

추가 읽기 

Metzker M. (2005). "염기 서열 분석의 새로운 기술". 게놈 연구 . 15 (12) : 1767-76. doi : 10.1101 / gr.3770505 . PMID  16339375 .